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動(dòng)物克隆胚產(chǎn)制過(guò)程,主要包括受核卵母細(xì)胞的去核操作、細(xì)胞注入卵的顯微操作、受核卵母細(xì)胞與注入細(xì)胞的細(xì)胞融合以及融合細(xì)胞的激活處理等四項(xiàng)技術(shù)。
克隆動(dòng)物所使用的細(xì)胞核來(lái)源,主要有已分化的細(xì)胞和未分化的胚葉細(xì)胞或胚干細(xì)胞。已分化細(xì)胞經(jīng)增生后仍維持其原有的細(xì)胞特性,如皮膚細(xì)胞只能增生為皮膚細(xì)胞,肝臟細(xì)胞也僅能增生成肝臟細(xì)胞;換言之,已分化細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育命運(yùn),無(wú)法回溯到如早期胚般具有發(fā)育成完整個(gè)體的全能性。未分化的胚葉細(xì)胞或胚干細(xì)胞,雖具有發(fā)育成個(gè)體中各類細(xì)胞的能力,惟截至目前為止,僅見四細(xì)胞期以前的早期胚的單一胚葉細(xì)胞,有發(fā)育成完整個(gè)體的紀(jì)錄,而八細(xì)胞期以上的仍無(wú)成功的案例;顯見此等單一未分化細(xì)胞,發(fā)育成個(gè)體的潛能仍局限于甚早的胚期,但若將這些未分化或已分化的單一細(xì)胞,注入卵母細(xì)胞,則可改變其命運(yùn)使之有能力發(fā)育成一完整生命體。
哺乳動(dòng)物的克隆并非僅靠一個(gè)細(xì)胞即可達(dá)成,醫(yī)學(xué)教.育網(wǎng)搜集整理此一細(xì)胞必須借助卵母細(xì)胞內(nèi)所含發(fā)軔因子,將基因組再程序化作用后,始具有發(fā)育能力。然因卵母細(xì)胞內(nèi)原已擁有雙套的染色體,若不加以去除,它與注入含兩套染色體的體細(xì)胞融合后,將形成四套染色體的異?,F(xiàn)象。因此,首要步驟是先將卵母細(xì)胞內(nèi)的雙套染色體去除,其后,再利用顯微操作技術(shù),將含有正常兩套染色體的單一細(xì)胞注入卵內(nèi)。
當(dāng)精子穿入卵透明帶與卵細(xì)胞膜接觸后,即產(chǎn)生自發(fā)性的融合現(xiàn)象,以促使精子細(xì)胞核進(jìn)入卵內(nèi),而完成受精作用,這是自然的精卵受精過(guò)程。然而,克隆胚產(chǎn)制過(guò)程中,供核細(xì)胞在注入卵膜間隙后,供-受核細(xì)胞間無(wú)法自發(fā)性發(fā)生如精卵接觸后的融合現(xiàn)象,而必須藉由外力迫使其融合。利用電刺激可促使細(xì)胞融合,乃因細(xì)胞經(jīng)電激處理后,細(xì)胞膜表面會(huì)形成約0.5奈米的小孔,經(jīng)證實(shí),此小孔即為導(dǎo)引兩細(xì)胞發(fā)生融合的媒介。
大多數(shù)哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞在排卵時(shí),其細(xì)胞周期乃靜休于第二次減數(shù)分裂中期。正常授精情況下,精子表面與卵母細(xì)胞貼附時(shí),在接觸位置引發(fā)卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加,并在3~6秒的時(shí)間內(nèi),迅速擴(kuò)及整個(gè)細(xì)胞,引導(dǎo)卵母細(xì)胞產(chǎn)生皮質(zhì)顆粒胞泌作用,防止多精入卵。隨后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度呈現(xiàn)周期性增加,并持續(xù)數(shù)小時(shí),進(jìn)而激活卵母細(xì)胞,使其恢復(fù)第二次減數(shù)分裂。
體細(xì)胞克隆時(shí),雖供核細(xì)胞已融入卵母細(xì)胞內(nèi),但供核細(xì)胞融入后,并無(wú)法激發(fā)如精卵融合后所產(chǎn)生的激活機(jī)制,因而需要以人為激活方式,模仿精子激活卵母細(xì)胞。利用電刺激或酒精,增加卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度,或直接以化學(xué)試劑抑制細(xì)胞靜止因子的活性,均可激活卵母細(xì)胞。
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