異丙酚和硫噴妥鈉對心肌內(nèi)游離Ca2+濃度的影響

材料和方法

動物

出生2～3天的SD乳鼠32只，性別不限

方法

1.心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)[1]

取出生2～3天乳鼠心臟，置于平衡液中，剪取心室部分，用平衡液淋洗3次，剪成1mm×1mm×1mm大小碎塊，置于0.15%胰蛋白酶液15ml中消化10分鐘，移取上清液至盛有100ml的1640培養(yǎng)液的燒瓶中，再加入胰蛋白酶消化液，重復(fù)6～7次。培養(yǎng)液離心（1000轉(zhuǎn)/分）10分鐘，棄上清液，加入1640培養(yǎng)液40ml，移至150ml培養(yǎng)瓶中，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁分離分化90分鐘，培養(yǎng)液細(xì)胞計數(shù)，校正至1×106cells/ml，接種于6孔板，每孔置一玻片，使細(xì)胞直接接種到玻片上。隔天換培養(yǎng)液，培養(yǎng)7～9天后的細(xì)胞用于實驗，

2.實驗分組

（1）對照組：不加任何藥物；

（2）實驗組A：Fura-2/AM負(fù)載后，按表1加入實驗用藥孵育10分鐘進(jìn)行Ca2+測定；

（3）實驗組B：加入實驗用藥孵育10分鐘后，加KCl40mmol/L，1分鐘后進(jìn)行Ca2+測定。

表1 異丙酚和硫噴妥鈉濃度(mmol.L－1)

3.Fura-2/AM負(fù)載與熒光測定[2]

用吸管吸掉培養(yǎng)液，貼在玻片上的細(xì)胞用HEPES緩沖液（NaCl1，KCl 5.4，CaCl2，1.2，MgCl2 1.2，HEPES10和葡萄糖5mmol/L）浸洗2次，然后在含有Fura-2/AM5μmol/L的HEPES緩沖液中孵育30分鐘，孵育溫度為37℃。孵育后，吸掉Fura-2/AM液，玻片再用HEPES液洗2次后，玻片置于熒光顯微鏡下的玻璃小槽中，采用德國UMSP30型分光光度計進(jìn)行Ca2+測定，發(fā)射波長為500nm，激發(fā)光為汞燈，以波長340nm和380nm的紫外光激發(fā)獲得熒光圖象，細(xì)胞影像經(jīng)計算機(jī)圖象處理系統(tǒng)處理后，以R340/380的代表細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度[3]。該熒光強(qiáng)度與Ca2+濃度成正比。采用同樣方法研究KCl、異丙酚和硫噴妥鈉對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，不同的是加藥后需在37℃繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘再進(jìn)行測定，激動劑KCl加入1分鐘即行測定。

4.統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，統(tǒng)計分析采用方差分析和t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、異丙酚和硫噴妥鈉對靜息心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的影響

濃度Ⅰ、Ⅱ的異丙酚和硫噴妥鈉對靜息心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度無明影響，濃度Ⅲ分別使靜息細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低20.19%和27.49%(圖1)。

圖1 硫噴妥鈉和異丙酚對靜息心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響

Ⅰ：外科麻醉藥血藥濃度；Ⅱ：兩倍血藥濃度；Ⅲ：四倍血藥濃度團(tuán)體t檢驗，P<0.05

二、異丙酚和硫噴妥鈉對KCl激發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流影響40mmol/L的KCl可使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較基礎(chǔ)值升高50.8%，異丙酚和硫噴妥鈉對高濃度KCl所激發(fā)Ca2+內(nèi)流均有明顯抑制，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ濃度異丙酚分別抑制15.48%、51.43%和61.74%；硫噴妥鈉分別抑制35.24%、58.09%和74.52%(圖2)。

圖2 硫噴妥鈉和異丙酚對KCl激發(fā)的心肌細(xì)胞鈣內(nèi)流的抑制程度對照組；Ⅰ：外科麻醉血藥濃度；Ⅱ：兩倍血藥濃度；Ⅲ：四倍血藥濃度

討論

Ca2+在細(xì)胞生命活動中所起的重要作用是眾所周知的，它調(diào)節(jié)著許多重要的細(xì)胞功能，如肌肉收縮、細(xì)胞運動、分泌功能、電興奮、糖代謝、受精、細(xì)胞分化和增殖等。另外，在許多病理生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平大大增加，引起細(xì)胞功能的改變，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，測定細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量及其藥物作用后的含量改變，有助于了解細(xì)胞功能的啟動、加強(qiáng)或抑制，并可闡明藥物作用的機(jī)制和環(huán)節(jié)。本研究采用Fura-2作為熒光探劑進(jìn)行鈣離子測定，它與鈣離子結(jié)合后具有很高的熒光強(qiáng)度和測量敏感性，對胞漿鈣的緩沖作用很小，F(xiàn)340代表與Ca2+結(jié)合的Fura-2數(shù)量，F(xiàn)380則表示未與Ca2+結(jié)合的Fura-2數(shù)量，用這兩個光譜的熒光比值作為指標(biāo)，不僅能提高測量的可靠性，而且可基本不受細(xì)胞密度及熒光探劑的影響[3～5]。

動物和臨床研究已證實，靜脈麻醉藥對心肌收縮功能有不同程度的抑制，部分藥物還可能產(chǎn)生新的或加重心肌缺血，其確切機(jī)制至今尚不完全清楚。本研究采用原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，以Fura-2熒光指示劑負(fù)載，觀察了異丙酚對靜息心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度和高濃度KCl激發(fā)引起的Ca2+內(nèi)流的影響，并與硫噴妥鈉進(jìn)行比較。文獻(xiàn)報道[6，7]，異丙酚和硫噴妥鈉產(chǎn)生外科麻醉時的血藥濃度分別為0.4mmol/L和4mmol/L，因此本實驗將0.4mmol/L異丙酚和4mmol/L硫噴妥鈉作為臨床劑量組，并以濃度成倍遞增，進(jìn)行等效量比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度異丙酚和硫噴妥鈉均使靜息心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣明顯減少。在實驗中，我們選用40mmol/L的鈣通道激動劑氯化鉀改變細(xì)胞外環(huán)境，作為對照組，觀察到細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加，這是由于鉀離子引起細(xì)胞膜去極化而激活心肌細(xì)胞膜上的鈣泵引起鈣內(nèi)流，而在預(yù)先加入不同濃度的異丙酚和硫噴妥鈉孵育10分鐘后，再加入40mmol/L的氯化鉀，1分鐘后進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組藥物對KCl所激發(fā)Ca2+內(nèi)流均有明顯抑制，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ濃度異丙酚分別抑制15.48%、51.43%和61.74%；硫噴妥鈉分別抑制35.24%、58.09%和74.52%（圖2）。說明異丙酚和硫噴妥鈉均可明顯抑制心肌細(xì)胞興奮時的鈣內(nèi)流，且硫噴妥鈉抑制心肌細(xì)胞鈣內(nèi)流的程度大于異丙酚。

可見，降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，不僅僅是通過抑制電壓依從性鈣通道而影響鈣內(nèi)流，而且也可影響靜息狀態(tài)下鈣的溢流過程。此結(jié)果提示，異丙酚和硫噴妥鈉在完整心肌的負(fù)性肌力作用可能與其部分抑制興奮-收縮耦聯(lián)過程中鈣離子內(nèi)流和抑制靜息狀態(tài)下的鈣溢流有關(guān)。