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堿性苦味酸速率法測定的原理是肌酐同堿性苦味酸反應形成一種紅色復合物，通常在510nm處根據測定一定時間內血清和標準液吸光度的增加量計算肌酐的含量。而膽紅素在510nm處也有較強光吸收，并且在氫氧化鈉的作用下，逐漸轉化為620nm處有強光吸收的膽綠素，而膽綠素在520nm處只有很弱的光吸收，這樣就掩蓋了肌酐本身的顯色反應的表現，從而使測定結果偏低，甚至出現負值。

經過查閱有關文獻和多次實驗，發(fā)現膽紅素在37℃和強堿環(huán)境下被氧化成膽綠素，導致510nm處吸光度減少的時間為兩者混合后50s以內，50s以后510nm吸光度下降緩慢或基本不變。我們根據這一發(fā)現并結合BECKMAN-CX5型全自動生化分析儀的特點，將原來的雙液體試劑反應步驟進行了改進，把原來的一步法改為兩步法。這種改進后的方法可以有效地消除膽紅素對肌酐測定的負影響。

1材料與方法

1.1試劑堿性苦味酸試劑

由上海豐匯醫(yī)學科技公司提供。肌酐標準液、高、中、低定值質控血清：美國進口。儀器：BECKMAN-CX5型全自動生化分析儀。

1.2方法

20l血清與200l試劑R1混合后，連續(xù)檢測該混合物分別在520nm和620nm處吸光度的變化。結果發(fā)現48s以后520nm吸光度下降緩慢或基本不變，而620nm處吸光度在32s后上升緩慢或基本不變。膽紅素被氧化成膽綠素的反應主要發(fā)生在標本和RI液混合后50s以內。

根據上述發(fā)現并結合BECKMAN-CX5型全自動生化分析儀的特點，調整后的反應參數。20l血清與200l試劑R1反應16s后加入50l試劑R2，在試劑R2加入后16s讀取起始吸光度，再過48s讀取終末吸光度，計算時用A2-A1=A，肌酐的含量為：肌酐=樣品A/標準A標準濃度。主波長520nm，副波長560nm，反應溫度37℃。

2結果

2.1兩種方法的比較選取膽紅素和肌酐正常參考值范圍的低值定值質控血清，分別用一步法和兩步法在BECKMAN-CX5型全自動生化分析儀各連續(xù)測定測定肌酐濃度20次，一步法測定結果：x=45.8mol/L，s=2.231，CV=4.9%；兩步法測定結果x=47.0mol/L，s=2.066，CV=4.4%.經配對t檢驗，t=1.9880.05，兩者無明顯差異，并且二者測定結果都接近靶值。再取一定量的高值定值質控血清，在BECKMAN-CX5型全自動生化分析儀分別用一步法和兩步法連續(xù)測定肌酐20天。一步法測定結果由于受膽紅素的影響，肌酐濃度明顯降低。而兩步法膽紅素對其影響不大與質控血清肌酐定值接近。配對t檢驗，t=8.37t，P＜0.05，兩者有明顯差異。

2.2方法的精確性

本方法低、中、高三種質控血清批內變異系數依次為4.8%、2.94%、0.84%，批間CV依次為3.79%、2.06%、1.52%，精密度良好。

2.3回收實驗

取3份膽紅素在117mol/L的血清做試驗，分別加入肌酐的濃度為40.9mol/L、20.3mol/L、10.6mol/L做肌酐測定回收試驗，測得回收濃度分別為38.9mol/L、19.3mol/L、10.7mol/L回收率依次為95.1%、95.2%、103.8%.3討論苦味酸速率法測定肌酐時，受高膽紅素負干擾而致結果明顯偏低，甚至出現負值。常用消除干擾方法有強堿法、表面活性劑法、氧化劑法、膽紅素氧化酶法、補償修飾、在部分機型上應用速率B法。

預處理法，由于添加了其他成分，操作不可避免地顯得冗長、繁瑣，另一方面因為附加成分的介入，破壞了原有反應體系，可能又會引起新的干擾。速率B法對儀器要求高而難以普及應用。而酶法測定肌酐由于價格的關系，目前只被國內少數醫(yī)院接受，難以普及。本方法沒有添加任何成分，原有的反應體系沒有改變，所以方法學評價和原方法一致，并且可以有效地消除膽紅素對肌酐測定的干擾，對膽紅素400mol/L的標本用生理鹽水稀釋1倍進行測試效果較好。該方法簡單、方便、準確，適合臨床推廣。