【摘要】本研究的目的是建立一種基于臨床移植需要的分離、培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSC）的方法，為配合造血干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。采用Percoll分離液（1.073g/ml）從新鮮成人骨髓穿刺液中分離MSC，應(yīng)用貼壁篩選法傳代培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原，成骨誘導(dǎo)體系（地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、抗壞血酸磷酸鹽50μmol/L）及脂肪誘導(dǎo)體系（地塞米松1μmol/L、牛胰島素5mg/L、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤0.5mmol/L、消炎痛60μmol/L）分別誘導(dǎo)MSC定向分化，通過細(xì)胞形態(tài)觀察及免疫化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：從成人骨髓液中分離培養(yǎng)出MSC，穩(wěn)定表達(dá)CD73、CD105、CD166，不表達(dá)CD34、CD45.定向誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶活性，脂肪細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴。結(jié)論：采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測及定向誘導(dǎo)分化，能夠從成人骨髓液中分離出MSC，并完成細(xì)胞表型及多向分化潛能的初步鑒定。本操作方案具有一定的臨床應(yīng)用價值。

　　【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞

　　間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcell，MSC）是最早自骨髓中分離出的一類具有自我更新及多向分化潛能的組織干細(xì)胞［1］。作為多種骨髓基質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞，MSC具有穩(wěn)定和修復(fù)造血微環(huán)境，促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖、分化，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞免疫功能，減輕移植排斥反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)［2］。MSC的發(fā)現(xiàn)為針對性解決造血干細(xì)胞移植，尤其是臍血移植中的干細(xì)胞數(shù)量相對不足及減少移植物抗宿主病提供了一個有效途徑［3，4］。本研究旨在建立一種從成人骨髓組織中分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增MSC的簡便易行的方法，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原和定向誘導(dǎo)分化，完成對獲得細(xì)胞的初步鑒定，為干細(xì)胞移植的臨床治療及組織損傷修復(fù)工程提供實驗基礎(chǔ)。

　　材料和方法

　　材料與試劑骨髓穿刺液5ml取自于健康成人移植供者，肝素抗凝，4℃保存。分離培養(yǎng)試劑：Percoll細(xì)胞分離液（1.073g/ml，Pharmacia產(chǎn)品），MSC專用培養(yǎng)基MesenCultTM（MSCbasalmediumandmesenchymalstemcellstimulatorysupplements，Stemcell產(chǎn)品）和胎牛血清（FBS，Stemcell產(chǎn)品），低糖及高糖DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco′smodifiedEaglemedium，GibcoBRL產(chǎn)品），胰蛋白酶（Sigma產(chǎn)品）；誘導(dǎo)試劑：地塞米松（dexamethasone）、β-甘油磷酸鈉（β-glycerol-2-phosphatedisodiumsalt）、抗壞血酸磷酸鹽（ascorbicacid-2-phosphatesalt）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰島素（insulin）、消炎痛（indomethacin）及堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒均為Sigma產(chǎn)品；流式相關(guān)抗體：鼠抗人單克隆抗體CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD166-PE（BDPharMigen產(chǎn)品）、CD105-FITC（SEROTEC產(chǎn)品）。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning）；超凈工作臺（廣州醫(yī)學(xué)生物工程研究所，GX-Ⅱ型），細(xì)胞培養(yǎng)箱（WTCbinder），流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BectonDickinson產(chǎn)品），倒置顯微鏡、照相機(jī)（Olympus），熒光顯微鏡、數(shù)碼相機(jī)（Nikon），低溫冷凍離心機(jī)（IECcentra）。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　方法人骨髓MSC的分離培養(yǎng)與傳代無菌條件下用等量PBS稀釋肝素抗凝骨髓液，在10ml消毒離心管中加入6mlPercoll分離液，再將4ml稀釋的骨髓液小心加至分離液表面，820×g離心20分鐘；吸取分界面的白色絮狀細(xì)胞層，用低糖DMEM培養(yǎng)基混勻，300×g離心10分鐘，洗滌2次。按2×105/cm2密度接種于含MSC專用培養(yǎng)基的75cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱全濕條件下培養(yǎng)48小時，全量換液，去除血細(xì)胞及其它未貼壁成分。用含10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況，每3天全量換液。細(xì)胞融合達(dá)80％以上，加入0.10%-0.15%胰蛋白酶-EDTA溶液2.5ml消化，按1∶4或1∶5傳代。取3代以上的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

　　MSC表面抗原的檢測取第3代生長達(dá)80%融合的貼壁細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，計數(shù)后取2×106個細(xì)胞，分裝6管，每管加入10μl熒光標(biāo)記抗體CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、CD166-PE，另設(shè)1管為空白對照，室溫避光30分鐘；用PBS反復(fù)洗2-3次，減少非特異性結(jié)合；加入200μlPBS混勻細(xì)胞，并以1%多聚甲醛固定，4℃保存，24小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

　　定向誘導(dǎo)MSC向成骨細(xì)胞分化的方法與鑒定收集消化后細(xì)胞，按3000cells/cm2接種于6孔板或24孔板，待多數(shù)細(xì)胞貼壁后，換用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，加入成骨誘導(dǎo)體系：地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、抗壞血酸磷酸鹽50μmol/L，每3天全量換液，維持2-3周。用堿性磷酸酶試劑盒染色。

　　定向誘導(dǎo)MSC向脂肪細(xì)胞分化的方法與鑒定收集消化后細(xì)胞，按1×104cells/cm2接種于6孔板或24孔板，待多數(shù)細(xì)胞貼壁后，換用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，加入脂肪誘導(dǎo)體系：地塞米松1μmol/L、牛胰島素5mg/L（或10mg/L）、IBMX0.5mmol/L、消炎痛60μmol/L（或200μmol/L），每3天全量換液，維持2周。鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪小滴形成情況，油紅O染色。隨機(jī)選擇10個非重復(fù)視野，計數(shù)脂肪細(xì)胞陽性率，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±D）表示。

　　結(jié)果

　　形態(tài)學(xué)觀察Percoll分離液分離獲得的細(xì)胞呈圓形，接種48小時全量換液后，可見少量長梭形貼壁細(xì)胞，周圍有明亮的圓形細(xì)胞存在。隨著培養(yǎng)時間延長，貼壁細(xì)胞迅速增多，呈漩渦狀生長，細(xì)胞變得細(xì)長而有突起，其間散在分布的細(xì)小黑色顆?？赡転檎掣叫詮?qiáng)的血細(xì)胞，胰蛋白酶消化傳代后逐漸消失。原代培養(yǎng)的MSC約15天長滿，傳代后約5-7天可達(dá)80％融合。連續(xù)培養(yǎng)12代，細(xì)胞生長情況無明顯差異，但繼續(xù)培養(yǎng)至15代，細(xì)胞生長速度明顯減慢，細(xì)胞變大，形狀不規(guī)則，胞內(nèi)顆粒增多。

　　流式細(xì)胞儀表型分析獲得的MSC均質(zhì)性好，高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD73（98.6％）、CD105（97.7％）、CD166（97.4％），不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD45（0.2％）、CD34（0.4％）。

　　ALP染色加入成骨誘導(dǎo)體系后約1周，可見細(xì)胞基質(zhì)出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣鈣沉積，至2-3周明顯增多，堿性磷酸酶染色強(qiáng)陽性；對照組細(xì)胞以未加誘導(dǎo)劑的含10％FBS的高糖-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，染色呈陰性。

　　油紅染色加入脂肪誘導(dǎo)體系后約2-3天，個別細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)微小明亮的脂肪滴，聚集在細(xì)胞一側(cè)。隨著誘導(dǎo)時間延長，出現(xiàn)脂滴的細(xì)胞增多，脂滴明顯增大并發(fā)生融合，細(xì)胞也變成方形或角形，體積變大。培養(yǎng)至2周，融合的脂肪滴幾乎充滿整個細(xì)胞，油紅染色呈明亮的橙紅色。采用5mg/L胰島素和60μmol/L消炎痛誘導(dǎo)，出現(xiàn)脂滴的時間早于10mg/L胰島素和200μmol/L消炎痛誘導(dǎo)，脂肪細(xì)胞陽性率（90.5%±4.5%）大于后者（70.5%±5.5%）。

　　討論

　　本研究中從新鮮人骨髓穿刺液中分離獲得的骨髓基質(zhì)細(xì)胞具有MSC的一般生物學(xué)特性：細(xì)胞為典型的成纖維細(xì)胞樣，呈漩渦狀貼壁生長，體外擴(kuò)增至12代，細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生明顯改變，高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD73（SH3，4）、CD105（SH2）、CD166，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45。在適宜的誘導(dǎo)條件下，MSC能夠較為容易地分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，且具有多向分化能力。由此，建立了從新鮮成人骨髓液分離培養(yǎng)、初步鑒定MSC的實驗方案。

　　MSC在骨髓有核細(xì)胞中含量相對稀少，約為1/105［5］，隨著年齡增長，骨髓中MSC的數(shù)量及增殖分化能力均顯著下降［6］。成人骨髓中還存在著造血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞成分，因此，必須找到合適的分離方法以獲得純度較高且數(shù)量較多的細(xì)胞產(chǎn)品，以滿足臨床需要。目前較為常用的方法有：根據(jù)MSC低密度特性采用密度梯度離心法；利用MSC與培養(yǎng)底物的粘附性采用貼壁篩選法；根據(jù)細(xì)胞大小和表面標(biāo)記采用免疫磁珠或流式細(xì)胞分選法。貼壁法直接接種骨髓細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中不斷換液，去除非貼壁細(xì)胞，最終得到富集的MSC，但純度較低；分選法得到的MSC純度較高，但細(xì)胞活率受影響，而且費用昂貴。采用1.073g/mlPercoll分離液進(jìn)行密度梯度離心并結(jié)合定期全量換液的貼壁篩選法，培養(yǎng)出的MSC純度提高。細(xì)胞接種和傳代密度對細(xì)胞的生長速度和分化狀態(tài)有一定影響，尤其是原代培養(yǎng)的人體細(xì)胞。本實驗采用2×105/cm2的密度接種細(xì)胞，48小時全量換液。傳代時按照1∶4或1∶5擴(kuò)增，細(xì)胞密度沒有嚴(yán)格限制，消化時將0.25％的胰蛋白酶稀釋為0.10％-0.15％，并盡量縮短作用時間，減少對細(xì)胞的刺激。這樣處理的細(xì)胞生長良好，多次傳代不會影響生物學(xué)特性。

　　體外研究發(fā)現(xiàn)，MSC具有多能分化的潛能，經(jīng)誘導(dǎo)可分化為不同的結(jié)締組織細(xì)胞，并把這一現(xiàn)象作為判斷MSC自我更新和多向分化能力的指標(biāo)之一。利用MSC易于分離擴(kuò)增、表型穩(wěn)定的生物學(xué)特性，可將其作為研究多能干細(xì)胞定向分化調(diào)控機(jī)制的理想模型。已發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員ERK、JNK、p38的特異性抑制劑能夠增強(qiáng)脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα、β及過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR-γ）的表達(dá)，促進(jìn)MSC向脂肪分化，同時抑制成骨分化［7］；骨髓基質(zhì)祖細(xì)胞在向成骨和脂肪細(xì)胞分化之間存在某種平衡，ERK可能是體內(nèi)決定MSC分化方向的開關(guān)［8］。本實驗聯(lián)合應(yīng)用地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽、胰島素、消炎痛、IBMX，誘導(dǎo)人骨髓MSC向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化。β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽可為成骨細(xì)胞的形成提供磷元素，并促進(jìn)鈣鹽沉積；地塞米松激活糖皮質(zhì)激素受體，促進(jìn)C/EBPs生成，同時降低脂肪細(xì)胞分化抑制因子pref-1的表達(dá)；胰島素與IGF-1、IRS等受體結(jié)合，激活A(yù)kt，Ras，ERK1/ERK2等信號傳導(dǎo)通路；消炎痛為非類固醇抗炎劑，是PPAR-γ的配體；IBMX提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），調(diào)控C/EBP（的表達(dá)，誘導(dǎo)PPAR-γ和C/EBPα產(chǎn)生，參與脂肪細(xì)胞的早期生成［9，10］。結(jié)果還顯示，低劑量胰島素和消炎痛誘導(dǎo)MSC分化為脂肪細(xì)胞的陽性率更高，提示這兩種藥物在高濃度時可能存在一定的拮抗效應(yīng)，胰島素促進(jìn)ERK的活化可能導(dǎo)致PPAR-γ磷酸化而降低其轉(zhuǎn)錄活性，部分抵消了消炎痛的作用，但該結(jié)果有待重復(fù)實驗加以證實。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　骨髓中存在著造血組織和非造血組織兩種成分，機(jī)體內(nèi)正常造血功能的維持依賴于造血干細(xì)胞的自我更新和造血微環(huán)境的完整與穩(wěn)定。MSC作為多種骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與造血微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)調(diào)控，并為機(jī)體新陳代謝及組織損傷修復(fù)提供“庫存”細(xì)胞，在干細(xì)胞移植和組織工程中具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究初步建立了從成人骨髓穿刺液中獲得和鑒定MSC的實驗方案，具有操作簡單、便于掌握、實驗周期較短等特點，適于在臨床實驗室推廣應(yīng)用，為今后MSC更好地進(jìn)行臨床治療打下基礎(chǔ)。

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