【摘要】目的：探討耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的機制。方法：對臨床分離的112株流感嗜血桿菌耐藥菌用紙片法作β-內(nèi)酰胺酶測定，用PCR法檢測產(chǎn)酶流感嗜血桿菌中的β-內(nèi)酰胺酶基因的存在。結(jié)果：紙片法測得產(chǎn)酶菌株32株，產(chǎn)酶率28.6％（32/112）；32株產(chǎn)酶菌中PCR法測β-內(nèi)酰胺酶基因陽性菌株29株，陽性率為90.6%（29/32），其中質(zhì)粒DNA模板組陽性為25株，基因組DNA模板組陽性為4例。

　　結(jié)論：（1）流感嗜血桿菌耐氨芐西林主要由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶所造成。（2）PCR法是研究流感嗜血桿菌是否攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因及該基因所在位置的簡便而有效的方法。

　　自1972年第一次發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌因產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶而致耐氨芐西林以來［1］，國外對耐氨芐西林流感嗜血桿菌的耐藥機制以及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的分子基礎(chǔ)研究，呈逐年增加趨勢。1978年Bryan等［2］首次報道了質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的流感嗜血桿菌。此后，圍繞流感嗜血桿菌中的質(zhì)粒編碼β-內(nèi)酰胺酶及其與耐氨芐西林的關(guān)系進行了許多研究。

　　我國由于流感嗜血桿菌的分離率較低，對此問題的研究一直沒有深入。本文作者在本實驗室成功提高流感嗜血桿菌分離率的基礎(chǔ)上［3，4］，分離獲得36株耐氨芐西林的流感嗜血桿菌，用紙片法測定它們產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的情況后，用PCR方法對產(chǎn)酶菌中β-內(nèi)酰胺酶基因的存在與否進行了檢測，對耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶機制作了初步分析。

　　1.材料和方法

　　1.1　流感嗜血桿菌的分離培養(yǎng)收集痰或咽拭子標(biāo)本，于1h內(nèi)接種于改良的哥倫比亞巧克力瓊脂平板中，置5%CO2孵箱，37℃孵育18～24h，對疑似流感嗜血桿菌的菌落分別于血瓊脂和營養(yǎng)瓊脂平板上作衛(wèi)星試驗，僅在血瓊脂平板上衛(wèi)星試驗陽性者為流感嗜血桿菌。用常規(guī)的紙片法（K-B法）對每個菌株作體外藥物敏感試驗，根據(jù)美國NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果。從平板上挑取耐氨芐西林的單菌落接種于含3ml液體HTM培養(yǎng)液的試管中，于5%CO2孵箱37℃孵育培養(yǎng)過夜，離心收集菌體用于質(zhì)粒制備等后續(xù)實驗。

　　1.2　紙片法測定β-內(nèi)酰胺酶將流感嗜血桿菌培養(yǎng)物經(jīng)超聲裂解后直接涂布于β-內(nèi)酰胺酶紙片上，在15min內(nèi)變紅者為陽性。超聲儀為BraonSonifier250，β-內(nèi)酰胺酶紙片購自O(shè)xid公司。

　　1.3　PCR法檢測β-內(nèi)酰胺酶基因

　　1.3.1　PCR引物針對β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)基因的PCR引物由本校分子遺傳學(xué)開放實驗室用PCGENE軟件PCRPLAN程序設(shè)計，上海生工生物工程公司協(xié)助合成。引物序列為：上游引物：5′TGGGTGCACGAGTGGGTTAC3′，下游引物：5′TTATCCGCCTCCATCCAGTC3′。

　　1.3.2　PCR反應(yīng)條件用PE2400型DNA擴增儀，50μlPCR反應(yīng)體系中含有模板DNA1μl、上游下游引物各1μl（濃度為25μmol/L），10×緩沖液5μl，dNTP混合物（10mmol/L）4μl，并用ddH2O補足至50μl（Mg2+的終濃度為1.5mmol/L），以94℃3min→（94℃1min→55℃1min→72℃1min，循環(huán)30次）→72℃7min→4℃保溫。PCR反應(yīng)后取10μl產(chǎn)物點樣，進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

　　1.3.3　PCR模板的制備細菌質(zhì)粒DNA用常規(guī)堿裂解法分離、RNaseⅠ消化、酚/氯仿抽提純化［3］；細菌基因組DNA用菌體凍融法制備：取少量細菌于1.5ml塑料離心管中，用蒸餾水重懸，加入少量溶菌酶于37℃水浴5min，放入液氮迅速冰凍5min，取出后立即放入37℃水箱融化5min，重復(fù)凍融3次，室溫下1×104r/min離心5min，吸取上清液到新的離心管，加入1.5倍體積的無水乙醇于-20℃沉淀30min，1.5×104r/min離心沉淀，用10μlTE溶解后備用。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　2.結(jié)果

　　2.1　流感嗜血桿菌的分離自1997年10月至1998年11月，從我院呼吸內(nèi)科及耳鼻咽喉科呼吸道感染患者中收集634份痰及咽拭子標(biāo)本，分離鑒定出112株流感嗜血桿菌，其中，藥敏試驗證明為氨芐西林耐藥的36株。

　　2.2　β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果36株耐氨芐西林流感嗜血桿菌中，紙片法測得產(chǎn)酶菌株32株，耐藥菌中產(chǎn)酶率88.9%（32/36）。

　　2.3　PCR法檢測β-內(nèi)酰胺酶基因結(jié)果用針對β-內(nèi)酰胺酶基因的上游和下游特異性引物擴增后，陽性條帶大小為486，擴增結(jié)果與預(yù)期值相同。32株產(chǎn)酶菌中PCR陽性菌株29株，陽性率為90.6%。其中以質(zhì)粒為模板PCR陽性菌株25株，占產(chǎn)酶菌的78.1%（25/32）；對7株質(zhì)粒DNA模板PCR陰性的菌株，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果有4株為陽性。

　　3.討論

　　國外對耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的分子機制研究，主要采用的方法是在大量培養(yǎng)細菌的基礎(chǔ)上，通過CsCl密度梯度超離心等方法獲取較大量的質(zhì)粒DNA，進行限制性內(nèi)切酶酶切分析、瓊脂糖凝膠電泳、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗等，大致分析質(zhì)粒DNA的大孝結(jié)構(gòu)，驗證質(zhì)粒介導(dǎo)的耐氨芐西林表型等，獲得質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)酶及其與耐氨芐西林藥物的關(guān)系等的可靠證據(jù)［6］。

　　但是，自然狀態(tài)的流感嗜血桿菌菌株中所攜帶的野生型質(zhì)粒的大孝結(jié)構(gòu)、拷貝數(shù)差異非常大，對細菌培養(yǎng)的數(shù)量、質(zhì)粒抽提純化的方法提出了很高的要求，其結(jié)構(gòu)的變異也造成電泳、酶切分析等方法難以做到精確分析質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。另外，野生型質(zhì)粒的分子量通常較大，常用的轉(zhuǎn)化實驗成功率不高；再加上野生型菌株中所含質(zhì)粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而這些方法都未能直接鑒定質(zhì)粒DNA中是否攜帶有編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因。

　　鑒于上述情況，本實驗設(shè)計了針對β-內(nèi)酰胺酶基因的特異性引物，對所分離獲得的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的耐氨芐西林流感嗜血桿菌中該酶編碼基因的存在情況進行了直接的PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，32株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的流感嗜血桿菌，用可靠的堿變性法獲取的質(zhì)粒DNA為模板進行PCR檢測，陽性率達到78.1%，而7株質(zhì)粒DNA模板PCR陰性的產(chǎn)酶菌株中，有4株在以染色體DNA樣品為模板進行的PCR反應(yīng)中表現(xiàn)陽性。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　這些結(jié)果提示耐氨芐西林的流感嗜血桿菌編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因主要存在于所攜帶的質(zhì)粒DNA上，而有少部分酶基因位于染色體DNA上，這與文獻報道的結(jié)論一致。從方法上看，本研究所采用的PCR法直接檢測耐氨芐西林流感嗜血桿菌中β-內(nèi)酰胺酶基因的方法，特異性高，標(biāo)本產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的核苷酸序列具有高度的特異性；敏感性高，PCR方法可將待測DNA片斷的量擴大百萬倍，可以檢測細菌含量極微的標(biāo)本；既可以測質(zhì)粒模板β-內(nèi)酰胺酶基因，也可以測染色體模板β-內(nèi)酰胺酶基因；如果配合PCR產(chǎn)物的序列測定等，還可用于β-內(nèi)酰胺酶分類、基因序列分析、分子流行病學(xué)調(diào)查等。

　　但PCR方法有假陽性的情況，如β-內(nèi)酰胺酶基因結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變異但未影響PCR引物結(jié)合位點時，可能存在PCR陽性但基因并無活性的情況。從理論上講，能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的菌株均應(yīng)有相應(yīng)的編碼基因存在，但本實驗中有3株P(guān)CR陰性，可能的原因是模板制備過程以及PCR反應(yīng)過程所造成的假陰性所致。雖然國外有用PCR方法檢測流感嗜血桿菌菌株、β-內(nèi)酰胺酶基因及其分類的報道［7］，國內(nèi)袁藝等［8］曾用PCR法檢測流感嗜血桿菌菌株，但對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的耐氨芐西林流感嗜血桿菌，分別以其質(zhì)粒DNA和染色體DNA為模板，用PCR方法測β-內(nèi)酰胺酶基因，研究其產(chǎn)酶和耐藥機制的，國內(nèi)外均未見報道。

　　參考文獻

　　1　Gu  BA， Woodall JB， Jones JF， et al. Ampicillin-resistant haemophilus influenzae［J］。 Lancet. 1974，2（7884）： 845

　　2　Bryan LE. Tra ferable chloramphenicol and ampicillin resistance in a strain of Haemophilus influenzae［J］。 Antimicrob Agents Chemother， 1978，14（1）：154

　　3　修清玉，賴國祥，王桂芳，等。改良哥倫比亞巧克力培養(yǎng)基分離流感嗜血桿菌［J］。中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1998，21（3）：161

　　4　方正，羅文侗，修清玉，等，流感嗜血桿菌下呼吸道感染的實驗與臨床研究［J］。中華結(jié)核與呼吸雜志，1999，22（4）：208

　　5　薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.金冬雁，黎孟楓譯。分子克隆實驗指南。第2版［M］。北京：科學(xué)出版社，1992.19～24

　　6　Bajanca-Lavado MP， Casin I， Vaz-Pato MV. Antimicrobial resistance and epidemiological study of Haemophilus influenzae strai  isolated in Portugal. The Multicentre Study Group［J］。 J Antimicrob Chemother， 1996， 38（4）：615

　　7　Tenover FC， Huang MB， Rasheed JK， et al. Development of PCR a ays to detect ampicillin resistance genes in cerebro inal fluid ample containing Haemophilus influenzae［J］。 J Clin Microbiol， 1994， 32（11）： 2729

　　8　袁藝，盧競，郭章溉，等。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測流感嗜血桿菌［J］。中華微生物學(xué)與免疫學(xué)雜志，1997，17（1）：25