【關(guān)鍵詞】  胃腫瘤； 中藥； 增殖細(xì)胞核抗原； 表皮生長(zhǎng)因子受體； 裸小鼠

　　中醫(yī)學(xué)認(rèn)為惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與痰邪為病有密切關(guān)系。魏品康教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制出消痰散結(jié)復(fù)方治療胃癌，取得較好療效［1，2］。本研究建立裸鼠胃腺癌模型，觀察該藥對(duì)裸鼠胃腺癌體內(nèi)生長(zhǎng)的抑制作用及其對(duì)胃癌組織中增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）表達(dá)的影響，探討消痰散結(jié)復(fù)方抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  實(shí)驗(yàn)材料

　　1.1.1  實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑  消痰散結(jié)方由半夏、天南星、茯苓、白芥子、陳皮、全蝎、雞內(nèi)金、炙甘草等組成，均購(gòu)自上海市藥材公司，產(chǎn)地明確，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定。常規(guī)方法煎煮，濃縮至含生藥0.46 kg/L備用。5氟尿嘧啶（fluorouracil， 5FU）10 ml，0.25 g，由上海旭東海普藥業(yè)有限公司出品（批號(hào)060404），購(gòu)自長(zhǎng)征醫(yī)院藥房。主要試劑鼠抗人PCNA單抗（稀釋度1∶100，代號(hào)M0879）和EGFR單抗（稀釋度1∶20，代號(hào)M0886）購(gòu)自美國(guó)DAKO公司?？股锼氐鞍祖溇鬲策^(guò)氧化物酶（streptavidin peroxidase， SP）連接法試劑盒和顯色試劑盒，購(gòu)自福建邁新公司。

　　1.1.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  BABL/c裸鼠，雄性，共45只，體質(zhì)量（20～22）g，8～10周齡，由中國(guó)科學(xué)院腫瘤生物技術(shù)研究所提供。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證書(shū)，編號(hào)0742；裸鼠動(dòng)物合格證書(shū)，醫(yī)動(dòng)字第02492號(hào)。

　　1.2  實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1  裸鼠MKN45胃腺癌模型建立  裸鼠MKN45人胃腺癌細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院腫瘤生物技術(shù)研究所提供。制備接種細(xì)胞懸液，無(wú)菌操作。體外培養(yǎng)MKN45細(xì)胞生長(zhǎng)密集時(shí)，用0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）消化1～2 min，傾出消化液，加入無(wú)血清1640液洗滌，離心，用無(wú)血清1640液配成接種細(xì)胞，濃度為2×106/ L.用相差顯微鏡觀察呈均勻的單細(xì)胞懸液。皮下接種：無(wú)菌操作，消毒皮膚，取l ml注射器，抽吸出0.4 ml細(xì)胞懸液，接種在裸鼠右前肢根部皮下。裸小鼠皮下移植傳代，取傳代后14 d左右的裸小鼠，無(wú)菌操作，從腋部皮下剝?nèi)∧[瘤組織，剔除纖維包膜，切開(kāi)，選取生長(zhǎng)良好、呈淡紅色、魚(yú)肉狀瘤組織，切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，置于生理鹽水中備用。裸鼠稱質(zhì)量后以75 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，沿上腹正中線切開(kāi)約1 cm，將備好的腫瘤組織塊植入。術(shù)后逐日觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，以小鼠腹部出現(xiàn)可觸及的包塊作為成瘤標(biāo)志，觀察小鼠一般活動(dòng)及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)等變化。

　　1.2.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及用藥  將接種后的BABL/c裸鼠隨機(jī)分為3組，消痰散結(jié)方組、化療組及荷瘤對(duì)照組，每組各15只，無(wú)特定病原菌（specific pathogen free， SPF）條件下分籠飼養(yǎng)于層流架內(nèi)。消痰散結(jié)方組，于接種后次日開(kāi)始每只裸鼠灌服消痰散結(jié)方濃縮煎劑0.4 ml/次（相當(dāng)于生藥9.2 g/kg體質(zhì)量）1次/d，連續(xù)灌胃6周?？瞻缀闪鰧?duì)照組，亦于接種后次日開(kāi)始每只裸鼠灌服生理鹽水0.4 ml/次，1次/d，連續(xù)灌胃6周?；熃M，5FU以生理鹽水稀釋成7.5 mg/ml，參照文獻(xiàn)及本組以往研究經(jīng)驗(yàn)按60 mg/kg腹腔注射，1次/周，連續(xù)用藥3周。

　　1.2.3  移植瘤生長(zhǎng)、小鼠活動(dòng)及營(yíng)養(yǎng)狀況觀察  接種后觀察小鼠活動(dòng)、進(jìn)食及營(yíng)養(yǎng)情況。6周后拉頸處死裸鼠，從腋部皮下完整剝?nèi)∧[瘤組織，剔除纖維包膜，于電子天平上稱取瘤質(zhì)量。運(yùn)用公式抑瘤率（%）＝（對(duì)照組治療后平均瘤質(zhì)量－用藥組治療后平均瘤質(zhì)量）/對(duì)照組治療后平均瘤質(zhì)量×100計(jì)算抑瘤率。完成觀察及稱取質(zhì)量的瘤組織用中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

　　1.2.4  移植瘤組織PCNA、EGFR的測(cè)定  SP法，蘇木素伊紅染色，石蠟切片脫蠟至水，微波修復(fù)抗原。每張切片滴加一抗（鼠抗人PCNA、EGFR）1滴，4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗3次后滴加生物素化二抗，每張切片上加1滴抗生物素蛋白鏈菌素過(guò)氧化物酶溶液，3，3‘二氨基及聯(lián)苯胺底物顯色10 min，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封閉。PCNA染色陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色，顆粒狀，位于胃癌細(xì)胞核內(nèi)，在×200油鏡下，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)以上的細(xì)胞作為分析基數(shù)，計(jì)數(shù)標(biāo)記PCNA指數(shù)，即被標(biāo)記細(xì)胞在一細(xì)胞群中所占的百分率。EGFR陽(yáng)性染色大多位于胞漿及胞膜上，個(gè)別位于胞核上，為棕黃色顆粒，按染色深度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分別計(jì)分。（1）染色深度：0分，無(wú)著色；1分，淺著色；2分，深著色。（2）陽(yáng)性細(xì)胞比例：0分，無(wú)著色；1分，著色≤1/3；2分，1/3＜著色≤2/3；3分，著色＞2/3.兩項(xiàng)結(jié)果相加＞3分為陽(yáng)性。

　　1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  采用多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較F檢驗(yàn)與不配對(duì)資料t檢驗(yàn)，不同組間表達(dá)比率采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)，運(yùn)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

　　2  結(jié)果

　　2.1  消痰散結(jié)方對(duì)裸鼠MKN45胃腺癌生長(zhǎng)的影響  荷瘤對(duì)照組在MKN45人胃腺癌接種于裸鼠皮下后14 d左右，腹部開(kāi)始觸及結(jié)節(jié)型腫塊，以后逐漸增大。中藥組晚于對(duì)照組觸及腫塊，化療組又稍晚于中藥組觸及腫塊?；熃M第23天死亡1只，且化療后期裸鼠消瘦明顯，懶動(dòng)，飲水、進(jìn)食狀況均較差。對(duì)照組4周后也逐漸有類似情況，但較化療組為輕。中藥組裸鼠整個(gè)治療周期活動(dòng)、飲食生長(zhǎng)狀況均較穩(wěn)定，優(yōu)于前二者。6周后處死裸鼠，稱取瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率，化療組和消痰散結(jié)方組抑瘤率分別為65.71%和52.72%，其瘤質(zhì)量與荷瘤對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），化療組較空白對(duì)照組差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1.

　　表1  各組移植瘤瘤質(zhì)量及抑瘤率（略）

　　Table 1  Tumor weight and inhibition rate in different groups

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs control group.

　　2.2  瘤組織病理學(xué)觀察  瘤體組織切片在光鏡下呈現(xiàn)低分化腺癌特征。對(duì)照組瘤細(xì)胞體積較大，呈橢圓形，胞漿紅染，細(xì)胞核大而色深，核漿比例明顯失調(diào)，化療組與消痰散結(jié)方組的瘤細(xì)胞相對(duì)較小，核漿比例也相對(duì)接近正常，胞漿有空泡，核結(jié)構(gòu)模糊。見(jiàn)圖1.

　　圖1  各組瘤組織病理學(xué)觀察（HE染色， ×200）（略）

　　Figure 1  Pathological observation of tumor tissue （HE， ×200）

　　A： Control group； B： Xiaotan Sanjie Recipe group； C： 5FU group.

　　2.3  瘤組織中PCNA、EGFR表達(dá)  消痰散結(jié)方組PCNA陽(yáng)性表達(dá)率低于空白對(duì)照組（P<0.05），化療組PCNA陽(yáng)性表達(dá)率與空白對(duì)照組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示中藥組及化療組細(xì)胞增殖程度均不如空白對(duì)照組活躍，見(jiàn)表2和圖2.EGFR陽(yáng)性表達(dá)情況如圖3及表3所示，消痰散結(jié)方可明顯下調(diào)胃癌細(xì)胞膜EGFR表達(dá)。

　　表2  各組瘤組織中PCNA陽(yáng)性表達(dá)（略）

　　Table 2  Positive expression of PCNA in different groups

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs control group.

　　圖2  各組瘤組織中PCNA陽(yáng)性表達(dá)（SP，×200）（略）

　　Figure 2  Positive expression of PCNA in different groups （SP， ×200）

　　A： Control group； B： Xiaotan Sanjie Recipe group； C： 5FU group.

　　圖3  各組瘤組織中EGFR陽(yáng)性表達(dá)（SP，×200）（略）

　　Figure 3  Positive expression of EGFR in different groups （SP， ×200）

　　A： Control group； B： Xiaotan Sanjie Recipe group； C： 5FU group.

　　表3  各組瘤組織中EGFR陽(yáng)性表達(dá)（略）

　　Table 3  Positive expression of EGFR in different groups

　　*P＜0.05， **P＜0.01， vs control group.

　　3  討論

　　腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖在一定程度上反映腫瘤細(xì)胞代謝和DNA合成狀態(tài)。PCNA相對(duì)分子量為36 000，既是控制細(xì)胞DNA合成的必需非組蛋白核內(nèi)多肽，也是細(xì)胞DNA合成期DNA多聚酶δ輔助蛋白。靜止細(xì)胞中PCNA含量很少，細(xì)胞進(jìn)入增生周期開(kāi)始逐漸增加，S期達(dá)到高峰，G2期和Ml期明顯下降，對(duì)DNA合成的調(diào)節(jié)和復(fù)制起重要作用。Tao 等［3］發(fā)現(xiàn)PCNA標(biāo)記指數(shù)與胃癌的浸潤(rùn)、分期密切相關(guān)，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)研究也證實(shí)PCNA的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)［4～6］，故PCNA被認(rèn)為是能較好判斷細(xì)胞增殖活性的內(nèi)源性標(biāo)記物，細(xì)胞增殖活性又反映腫瘤的惡性傾向。腫瘤自分泌假說(shuō)認(rèn)為，生長(zhǎng)因子受體質(zhì)或量的異常，生長(zhǎng)因子類物質(zhì)產(chǎn)生的異常，受體后信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)紊亂，生長(zhǎng)因子或抑制因子減少等等，均可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制失控，細(xì)胞惡性增殖可引起腫瘤發(fā)生。EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性，當(dāng)與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合形成復(fù)合體后，其自身酪氨酸殘基被磷酸化，幾乎所有信號(hào)傳導(dǎo)通路均以蛋白激酶或磷酸酶的激活作為調(diào)節(jié)細(xì)胞生物效應(yīng)的手段，或作為與其他信號(hào)系統(tǒng)相互溝通聯(lián)系的交匯點(diǎn)［7］。研究表明EGFR在生理狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化具有調(diào)節(jié)作用，當(dāng)EGFR過(guò)度表達(dá)時(shí)，可引起細(xì)胞生長(zhǎng)增殖調(diào)節(jié)機(jī)制的失控，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖［8，9］。胃癌屬于中醫(yī)學(xué)“伏梁”、“積聚”、“胃脘痛”、“胃反”、“噎膈”等病證范疇，文獻(xiàn)對(duì)其形成的病因病機(jī)有諸多描述，其中“痰凝”為重要病理因素之一。魏品康教授30余年來(lái)一直從事消化系統(tǒng)惡性腫瘤防治工作，認(rèn)為胃癌多因長(zhǎng)期飲食不慎，勞倦所傷，影響脾胃運(yùn)化功能，導(dǎo)致水濕不化，日久凝聚為痰，進(jìn)一步影響氣血運(yùn)行，導(dǎo)致痰凝血壅，結(jié)而成塊，故而主張消痰散結(jié)論治，驅(qū)邪為主，邪去則正安，遂擬定消痰散結(jié)方。方中以南星、半夏、陳皮、白芥子等消痰散結(jié)，再以全蝎破瘀散結(jié)，甘草調(diào)和諸藥，并與雞內(nèi)金等協(xié)助減輕南星、半夏、全蝎毒副作用，攻補(bǔ)兼施，但偏重于攻。在臨床應(yīng)用多年，證實(shí)可明顯改善患者生活質(zhì)量，提高中位生存期［1］。本實(shí)驗(yàn)即在臨床研究基礎(chǔ)上，建立裸鼠胃癌模型，從實(shí)驗(yàn)研究角度對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討，結(jié)果提示消痰散結(jié)方對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有一定抑制作用，并進(jìn)一步檢測(cè)了不同分組胃癌組織中反應(yīng)細(xì)胞增殖活性的PCNA表達(dá)，以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有調(diào)節(jié)作用的EGFR表達(dá)，結(jié)果提示消痰散結(jié)方能下調(diào)細(xì)胞PCNA標(biāo)記指數(shù)以及細(xì)胞膜EGFR表達(dá)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明消痰散結(jié)方可通過(guò)抑制PCNA蛋白和細(xì)胞膜EGFR表達(dá)，干擾腫瘤細(xì)胞DNA合成，對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生影響，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖。本文從實(shí)驗(yàn)研究角度證實(shí)了消痰散結(jié)方的抗腫瘤功效，有關(guān)此方藥的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入探討。

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