【摘要】  觀察健脾活血方對酒精復合內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導的肝損傷大鼠庫普弗細胞活化信號通路的影響。方法：采用Lieber-Decarli酒精飲料飼養(yǎng)6周誘導的酒精性肝損傷模型，分設正常組，無酒精飲料組，酒精飲料組和酒精飲料加健脾活血方組，造模第3周起灌胃給藥或蒸餾水至第6周末，各組再以LPS 10 mg/kg 一次性灌胃，3.5 h后取材。檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase， ALT）活性和肝組織甘油三酯（triglyceride， TG）含量；HE染色觀察大鼠肝組織病理改變；CD68免疫組化觀察庫普弗細胞活化狀態(tài)；ELISA法檢測門脈血漿腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）含量；Western-blotting方法檢測肝組織TNF-α、磷酸化的IκB（phosphorylation-IκB， P-IκB）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）、CD68蛋白表達。結果：經(jīng)健脾活血方干預后，大鼠肝臟組織病理損傷減輕，肝組織TG含量以及血清ALT活性和門脈血漿TNF-α含量下降；同時，大鼠肝臟TNF-α、P-IκB、TLR4和CD68蛋白表達明顯減輕。結論：健脾活血方對酒精復合LPS誘導的肝損傷大鼠CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α具明顯抑制作用。

　　【關鍵詞】  肝疾病， 酒精性

　　酒精性肝病長期以來是西方國家的主要肝臟疾病之一，而近年來的流行病學調(diào)查資料顯示，其發(fā)病率在我國也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢［1］。目前，圍繞“二次攻擊”學說， 內(nèi)毒素或脂多糖（lipopolysaccharides， LPS） 激活肝臟庫普弗細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子是酒精性肝損傷研究的熱點之一?，F(xiàn)已知，LPS經(jīng)內(nèi)毒素受體如CD14、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）的作用激活肝臟庫普弗細胞，活化核因子κB（nuclear factor κB， NF-κB）信號啟動炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）的轉(zhuǎn)錄，導致肝損傷。我們前期的研究結果已經(jīng)證實，中藥復方健脾活血方具有抗Lieber-Decarli酒精飲料誘導的大鼠酒精性肝損傷的作用，并且進一步證實該方能夠通過抑制酒精引起的腸滲漏［2］及脂質(zhì)過氧化［3］來達到上述的藥理作用。為了進一步探討健脾活血方抗酒精性肝損傷的作用機制，本文觀察了該方對于Lieber-Decarli酒精飲料復合LPS灌胃二次攻擊誘導的大鼠肝損傷模型中LPS激活肝臟庫普弗細胞信號通路的影響，現(xiàn)報道如下。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 動物和藥物 SD雄性大鼠42只，體質(zhì)量150～160 g，購自中國科學院上海實驗動物中心。健脾活血方由白術、白芍、丹參、澤瀉、五味子、姜黃、枳殼和葛根等組成。先提取藥物（白術和枳殼等）中的揮發(fā)性成分，然后再將藥物水提，最后將揮發(fā)油成分混合入水提物中。動物用藥生藥含量為 0.9 g/ml .

　　1.1.2 主要試劑 Lieber-Decarli酒精飼料：無水乙醇，購自上海振興化工一廠產(chǎn)品，分析純AR，批號200402359；干酪素，L-胱氨酸，DL-甲硫氨酸，玉米油，橄欖油，紅花油，麥芽糖糊精，纖維素，水溶性膳食纖維，酒石酸氫膽堿，黃原膠，磷酸氫鈣，氯化鈉，檸檬酸鉀，硫酸鉀，氧化鎂，硫酸錳，硫酸亞鐵，碳酸鋅，碳酸銅，碘酸鉀，亞硒酸鈉，硫酸鉻鉀，氟化鈉，蔗糖，鹽酸維生素B1，核黃素，鹽酸維生素B6，煙酸，泛酸鈣，葉酸，維生素H，維生素B12， 乙酸維生素A， 維生素D3，乙酸維生素E，甲基萘醌亞硫酸氫鈉，對 氨基苯甲酸，肌醇，右旋糖，中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司產(chǎn)品。LPS（Escherichia coli 0111：B4），為美國Sigma公司產(chǎn)品，實驗時用滅菌注射用水溶解，工作終濃度1 mg/ml.檢測試劑：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine amin-otransferase， ALT）測定試劑盒，為衛(wèi)生部上海生物制品研究所產(chǎn)品；甘油三酯（triglyceride， TG）測定試劑盒，為浙江東甌生物工程有限公司產(chǎn)品。大鼠血漿TNF-α檢測試劑盒，為R&D公司產(chǎn)品；DAB濃縮顯色液和小牛血清白蛋白，均為上海華美生物工程公司產(chǎn)品；胃蛋白酶和多聚賴氨酸，均為北京鼎國生物技術公司產(chǎn)品；二甲苯和蘇木素染料，均為上?；瘜W試劑廠產(chǎn)品；中性樹膠，為上海標本模型廠產(chǎn)品；30%過氧化氫，為上海桃浦化工廠產(chǎn)品；苯甲基磺酰氟，為Serva公司產(chǎn)品；三氨基甲烷，為上海生物工程公司產(chǎn)品；β巰基乙醇、吐溫20、十二烷基硫酸鈉、N，N，N‘，N’-四甲基乙二胺、甘氨酸和40%Acr/Bis溶液，均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；甲醇，為Burdick & Jackson公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜和溴酚藍，均為Amersham公司產(chǎn)品。Nonidet P40和蛋白酶抑制劑，均為Roche公司產(chǎn)品；化學發(fā)光底物，為Pierce公司產(chǎn)品；脫脂奶粉，為Nestle公司產(chǎn)品；醫(yī)用X光膠片（12.7 cm×18.7 cm），為上海海鷗照相機有限公司感光材料廠產(chǎn)品；多克隆羊抗大鼠TNF-α抗體，為R&D公司產(chǎn)品。單克隆小鼠抗大鼠磷酸化IκB抗體（phosphorylation-IκB， P-IκB），為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；多克隆羊抗大鼠TLR4抗體，為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品；單克隆小鼠抗大鼠CD68抗體，為Serotec公司產(chǎn)品；多克隆兔抗羊Ⅱ抗，為Jackson Immu-noresearch Laboratories Inc公司產(chǎn)品；單克隆兔抗小鼠Ⅱ抗，為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 造模與分組 參照Lieber-DeCarli酒精飼料配方和美國杰弗遜大學醫(yī)學院酒精性肝病研究中心相關飼養(yǎng)方案，42只大鼠隨機分正常對照組（ 6只 ）；酒精液體飼料組（24只）和無酒精液體飼料組（簡稱對照組，12只），均單居。除正常組外，分別采用特制負壓式帶刻度玻璃容器，每日消毒后定量飼以酒精熱量占36%的Lieber-DeCarli酒精飼料和含相同熱量的無酒精對照飼料。第3周起，酒精液體飼料組再次隨機分為酒精液體飼料組（簡稱模型組，12只）、酒精液體飼料加健脾活血方組（簡稱中藥組，12只）。中藥組在給予酒精飼料的同時，灌胃給藥0.01 ml/g，1次/d，正常組、模型組和對照組按相同標準給予蒸餾水。

　　1.2.2 取材 造模6周后，大鼠禁食5 h，分別灌服LPS 10 mg/kg（間隔10 min灌1只），并在灌服LPS 3.5 h后，分別采取門靜脈血（無熱源肝素抗凝管收集制備血漿）、下腔靜脈血和肝組織。

　　1.2.3 觀察項目和方法 （1）大鼠一般狀態(tài)、進食量及體質(zhì)量變化。（2）肝組織病理變化：HE染色，光鏡下觀察肝組織炎癥變化和脂肪變性程度。 （3）血 清ALT活性和肝組織TG含量：采用生化試劑盒檢測。（4）門脈血漿TNF-α含量測定：采用ELISA試劑盒測定。（5）肝組織CD68蛋白表達及分布：免疫組化染色法。Ⅰ抗，PBS稀釋，工作濃度1∶100；Ⅱ抗，PBS稀釋，工作濃度1∶250.（6）肝組織CD68、TLR4和TNF-α蛋白表達：Western-blotting法。

　　1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 11.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料用 x ± s 表示，組間兩兩比較用 t 檢驗。

　　2 結果

　　2.1 一般狀態(tài)、進食量及體質(zhì)量變化 對照組1只大鼠在灌飼LPS時意外死亡。各組大鼠進食量和熱卡攝入無明顯差異，排除飲食及酒精量的差異對實驗結果的影響。造模前后同期各組大鼠體質(zhì)量無 明顯差異。

　　2.2 肝臟病理變化 模型組大鼠視野內(nèi)1/3以上的肝細胞出現(xiàn)脂肪變性，以肝腺泡3帶為中心，其余的大部分肝細胞變性、腫脹，胞漿內(nèi)充滿小的空泡，即以酒精性脂肪肝病理表現(xiàn)為主。中藥組大鼠肝細胞脂肪變性程度明顯減輕，脂滴數(shù)量減少。此外，對照組大鼠有3只也偶見有散在小泡狀脂肪滴。見圖1.

　　2.3 肝臟TG含量變化 模型組肝TG含量為正常組的9.4倍和對照組的4.9倍。健脾活血方可以明顯降低肝組織TG含量，中藥組TG含量均值為模型組的67%.見表1.

　　2.4 門靜脈血漿TNF-α含量和血清ALT活性的變化 模型組門靜脈血漿TNF-α含量和血清ALT活性明顯高于正常組和對照組。而中藥組的上述指標均明顯低于模型組。見表1.

　　2.5 肝臟庫普弗細胞活化狀態(tài) CD68免疫組化染色顯示，正常組和對照組大鼠肝臟肝小葉匯管區(qū)肝竇內(nèi)可見極少量CD68陽性染色。模型組大鼠肝臟可見明顯的CD68陽性染色區(qū)域，集中在肝細胞脂肪變性及炎細胞浸潤明顯的匯管區(qū)肝竇內(nèi)。中藥組大鼠CD68陽性染色較模型組明顯減少，但分布同模型組。見圖1.

　　2.6 肝組織CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表達的變化 正常組大鼠肝組織CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白均有少量表達，對照組TNF-α蛋白表達也略有增加，模型組大鼠肝組織CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表達則均明顯增加，而中藥組的上述蛋白表達均明顯低于酒精模型組。見圖2.

　　圖1 各組大鼠肝組織HE染色和CD68免疫組化染色（×200） （略）

　　Figure 1 HE staining for liver tissue and immunohistochemical staining for CD68 （×200）

　　A： HE staining for liver tissue； A1： Normal group； A2： Control liquid diet group； A3： Ethanol liquid diet group； A4： Jianpi Huoxue Decoction group. B： Immunohistochemical staining for CD68； B1： Normal group； B2： Control liquid diet group； B3： Ethanol liquid diet group； B4： Jianpi Huoxue Decoction group.

　　表1 大鼠肝組織TG含量、血漿TNF-α含量和血清ALT活性的變化（略）

　　Table 1 Contents of TG in liver， TNF-α in portal vein plasma and activity of ALT in serum

　　*P <0.05，*P <0.01， vs ethanol liquid diet group；△P <0.05，△△P <0.01， vs control liquid diet group.

　　圖2 健脾活血方對酒精性肝損傷復合LPS攻擊大鼠肝組織CD68、TLR4、P-IκB 、TNF-α蛋白表達的影響（Western-blotting）（略）

　　Figure 2 Effects of Jianpi Huoxue Decoction on protein expressions of CD68， TLR4， P-IκB and TNF-α in rats with liver injury induced by Lieber-Decarli diet and LPS （Western-blotting）

　　1： Normal group； 2： Control liquid diet group； 3： Ethanol liquid diet group； 4： Jianpi Huoxue Decoction group；

　　*P <0.05，*P <0.01， vs ethanol liquid diet group.

　　3 討論

　　近年來，由于“二次攻擊”學說被不斷深入廣泛地研究，酒精性肝病的發(fā)病機制研究取得了較大進展。LPS是革蘭陰性菌細胞膜的主要脂質(zhì)成分，可以激動強烈的炎癥反應。大量研究表明，LPS通過活化庫普弗細胞（即肝巨噬細胞）產(chǎn)生炎癥因子參與了酒精性肝損傷的病理過程，庫普弗細胞源性的TNF-α在實驗性酒精性肝病中發(fā)揮了重要的病理作用［4］。嗜酒者空腸微生物系中，革蘭陰性菌含量明顯增高［5］。長期飼喂酒精的大鼠，用抗生素對其進行腸內(nèi)滅菌或飼以乳酸菌，可降低酒精飼喂大鼠內(nèi)毒素水平和肝損傷的程度，防止轉(zhuǎn)氨酶的升高［6］。LPS體內(nèi)主要來源于腸道革蘭陰性桿菌。長期的酒精作用可致使腸道通透性發(fā)生改變引起腸滲漏［7］，從而使腸道內(nèi)的內(nèi)毒素進入血液。LPS信號的傳遞依賴于LPS受體的存在與活化。已經(jīng)證實TLR4是革蘭陰性菌LPS特異性受體［8］。TLR4基因突變的C3H/HeJ小鼠經(jīng)4周胃內(nèi)酒精灌注后，肝組織損 傷程度、轉(zhuǎn)氨酶水平、TNF-α mRNA表達水平均較野生型對照組明顯減輕［9］。LPS同血液中的LPS結合蛋白（LPS binding protein， LBP）形成復合物與效應細胞膜上的膜型CD14相結合，在低濃度下激活效應細胞（如單核/巨噬細胞，庫普弗細胞等）［8］。由于CD14缺乏跨膜功能區(qū)，LPS-LBP復合物與庫普弗細胞表面的CD14結合后，在模式識別受體TLR4的參與下完成信號轉(zhuǎn)導。TLR4下游信號通過胞內(nèi)一系列受體相關信號分子的參與最終誘導I-κB發(fā)生磷酸化降解，使NF-κB轉(zhuǎn)位進入細胞核啟動炎癥因子如TNF-α的轉(zhuǎn)錄，從而導致肝損傷。中醫(yī)對于酒精性肝病有“傷酒”、“脅痛”、“酒癖”、“酒疸”和“酒臌‘等病名，認為飲酒為外因，而素體稟賦不足、脾胃虛弱為內(nèi)因，健脾等調(diào)理脾胃運化功能的治療方法是臨床治療酒精性肝病的基本治法治則。我們根據(jù)中醫(yī)基礎理論及長期的臨床實踐總結了治療酒精性肝病的有效方劑健脾活血方，并經(jīng)前期的動物實驗已經(jīng)證實該方具有抗酒精性肝損傷的藥理作用。本研究重點觀察了健脾活血方對Lieber-Decar-li酒精飲料誘導的大鼠酒精性肝損傷復合LPS灌胃二次攻擊模型中LPS誘導庫普弗細胞活化信號通路的影響。大鼠肝臟組織病理學、血清ALT水平的觀察結果提示，該方能夠有效地抑制Lieber-Decarli酒精飲料復合LPS灌胃二次攻擊所致的肝損傷。同時，門脈血漿TNF-α含量、肝組織TNF-α蛋白表達檢測結果均提示該方能夠顯著降低造模后大鼠體內(nèi)TNF-α的表達，即健脾活血方能夠抑制該模型中炎癥因子TNF-α的釋放。進一步觀察LPS活化庫普弗細胞信號通路的上游P-IκB及LPS受體表達情況發(fā)現(xiàn)，經(jīng)健脾活血方干預后，大鼠肝臟P-IκB和TLR4的蛋白表達明顯較模型組減輕。同時，免疫組化與Western-blotting檢測的結果也表明作為庫普弗細胞表面標志分子的CD68蛋白表達在該方干預后明顯較模型組減輕，即健脾活血方能夠抑制該模型大鼠肝臟庫普弗細胞的活化。本研究的結果提示，健脾活血方具有抑制Lieber-Decarli酒精飲料復合LPS灌胃二次攻擊所致的肝損傷及炎癥因子TNF-α釋放的藥理作用。同時，該方對肝臟庫普弗細胞活化及LPS受體TLR4蛋白表達也具有明顯的抑制作用。

　　【參考文獻】

　　1Zhuang H. Epidemiology of alcoholic liver disease. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2003； 11（11）： 689. Chinese. 莊輝。 酒精性肝病的流行病學。 中華肝臟病雜志， 2003； 11（11）： 689.

　　2Hu YY， Fang ZH， Cui JW， et al. Relationship betweenalcoholic liver injury and gut permeability and the alle-viating effect of Chinese herbs. Ke Xue Ji Shu Yu Gong Cheng. 2005； 5（22）： 1770-1771， 1776. Chinese with abstract in English. 胡義揚， 方志紅， 崔劍巍， 等。 酒精性肝損傷與小腸通透性改變的關系及中藥的干預作用。 科學技術與工程。 2005； 5（22）： 1770-1771， 1776.

　　3Cui JW， Hu YY， Fang ZH， et al. Intervention effects of Jianpi Liqi Huoxue Decoction on lipid peroxidative liver injury induced by alcohol. Chin J Integr Med. 2006； 12（4）： 281-286.

　　4Tsukamoto H， Lu SC. Current concepts in the patho-genesis of alcoholic liver injury. FASEB J. 2001； 15（8）： 1335-1349.

　　5Thurman RG. Mechanisms of Hepatic Toxicity II. Al-coholic liver injury involves activation of Kupffer cells by endotoxin. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 1998； 275（4）： G605-G611.

　　6Adachi Y， Moore LE， Bradford BU， et al. Antibiotics prevent liver injury in rats following long-term exposure to ethanol. Gastroenterology. 1995； 108（1）： 218-224.

　　7Hansen J， Cherwitz DL， Allen JI. The role of tumor necrosis factor-α in acute endotoxin-induced hepatotox-icity in ethanol-fed rats. Hepatology. 1994； 20（2）： 461-474.

　　8Su GL. Lipopolysaccharides in liver injury： molecular mechanisms of Kupffer cell activation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002； 283（2）： 256-265.

　　9Uesugi T， Froh M， Arteel GE， et al. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 2001； 34（1）： 101-108.