細(xì)胞生物學(xué)：Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞

2007-08-10 14:54 來(lái)源：

打印

字體：大小

　　測(cè)定細(xì)胞免疫功能首先要從人或動(dòng)物外周血或組織中獲取有活性的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等。取得有活性的細(xì)胞應(yīng)根據(jù)不同目的，采用不同方法，考慮（1）細(xì)胞純度；（2）細(xì)胞獲得量；（3）細(xì)胞活力；（4）使用方法的簡(jiǎn)易程度和本室條件等。目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞。

　　（一）　原理：

　　常用來(lái)分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分層液比重是 1.077±0.001 的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F／H）分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，犌W水性高，平均分子量為400，000，當(dāng)密度為1.2g／ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過(guò)生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。

　?。ǘ》椒ǎ?/P>

　　1.　在短中管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。

　　2.　取肝素抗凝靜脈血與等量Hank‘s液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。

　　3.　離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank‘s液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶（如下圖），單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。

　　4.　用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積的Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細(xì)胞兩次。

　　5.　末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2％臺(tái)盼蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。

　　單個(gè)核細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)／1毫升細(xì)胞懸液）＝

　　4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)
　　──────────　×　104×2（稀釋倍數(shù)）
　　　　　　4

　　6.　細(xì)胞活力檢測(cè)：死的細(xì)胞可被染成蘭色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞。計(jì)算出活細(xì)胞百分率。

　　　　　　　　　　活細(xì)胞數(shù)
　　活細(xì)胞百分率＝──────　×100％
　　　　　　　　　　總細(xì)胞數(shù)

　　用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達(dá)80～90％，活細(xì)胞百分率在95％以上。

　?。ㄈ≡噭┖筒牧希?/P>

　　比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺（商品名為淋巴細(xì)胞分離液）。

　　Hank‘s液（無(wú)Ca2＋、Mg2＋）

　　10％小牛血清RPMI1640

　　0.2％臺(tái)酚蘭染色液，用生理鹽水或等滲的PBS配制。

　　肝素用Hank‘s液或生理鹽水稀釋成500單位／ml，牽9凝人外周血肝素用量約為50單位／1毫升血。

　　短中管、毛細(xì)滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。

　　無(wú)菌干燥注射器針頭。

　　碘酒，75％酒精，無(wú)菌棉球，鑷子，橡皮止血帶。

　　血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡、水平式離心機(jī)。

　?。ㄋ模∽⒁馐马?xiàng)：

　　1.　抽取人外周靜脈血時(shí)要注意無(wú)菌操作。

　　2.　操作全程應(yīng)盡可能短時(shí)間內(nèi)完成，以免增加死細(xì)胞數(shù)。

　　3.　用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速的增加和減少要均勻、平穩(wěn)，使保持清晰的界面。

　　4.　小鼠、兔等動(dòng)物淋巴細(xì)胞比重與人不同，犛&配制相應(yīng)密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。

　?。ㄎ澹「戒?/P>

　　1.　Hank‘s液（無(wú)Ca2＋、Mg2＋）配制法

　　NaCl 8.0克

　　KCl 0.4克

　　Na2HPO4.12H2O 0.12克

　　KH2HPO4　　　　　　　　0.06克

　　葡萄糖　　　　　　　　　　1.0克

　　雙蒸水　　　　　　　　　 1000毫克

　　1％酚紅液　　　　　　　　　 2毫克

　　將上列成分混合后溶化，分裝于500毫升鹽水瓶?jī)?nèi)，8磅15分鐘滅菌，4℃冰箱保存，臨用時(shí)調(diào)PH至7.3～7.6.

　　2.　細(xì)胞分層液配制法

　　9％聚蔗糖　　　　　　　　　24份

　　34％泛影葡胺　　　　　　　 10％

　　混合，測(cè)比重為1.077～1.078，G5玻璃濾器過(guò)濾除菌。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/P>

　　3.　磷酸緩沖液（PB）

　　原液：

　　A液： 0.2M NaH2PO4溶液

　　NaH2PO4 　　　　　　　　　　27.6克

　　或NaH2PO4.2H2O 　　　　　　31.2克

　　蒸餾水　溶解至　　　　　　　　1000毫升

　　B液：0.2M Ha2HPO4溶液

　　Ha2HPO4.12H2O 　　　　　　71.6克

　　蒸餾水溶解至1000毫升

　　各種不同PH值PB的配法

　　───────────────────────────────────────
　　PH　　　　　7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
　　───────────────────────────────────────
　　A液（ml） 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
　　B液（ml） 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
　　───────────────────────────────────────

　　舉例：　0.1M 　PH7.2PB

　　A液　　　28毫升

　　B液　　　72毫升

　　加蒸餾水　 100ml

　　4.　血球保存液

　　葡萄糖　　2.05克　枸椽酸鈉　　0.8克

　　氯化鈉　　0.42克　蒸餾水　　 100毫升

　　將上述成分混勻，略加溫使其溶解，分裝小瓶（100毫升）。經(jīng)10磅、10分鐘高壓滅菌。4℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　5.　RPMI-1640培養(yǎng)液：

　　RPMT-1640（FLOW公司出品）　　　　1袋

　　三蒸水　　　　　　　　　　　 1000毫升

　　電磁攪拌30分鐘：1N　HCl調(diào)PH7.2～7.4（約加2.5毫升），過(guò)濾除菌，作無(wú)菌試驗(yàn)，4℃保存。