[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯

　　1.了解細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理和基本方法

　　2.磷酸鈣沉淀法的基本技術(shù)要點(diǎn)

　　[實(shí)驗(yàn)原理]

　　磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復(fù)合物的一種將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法，磷酸鈣被認(rèn)為有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面的結(jié)合。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲作用進(jìn)入靶細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染的DNA可以整合到靶細(xì)胞的染色體中從而產(chǎn)生有不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。這種方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成。可廣泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細(xì)胞，不但適用于短暫表達(dá)，也可生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

　　[儀器、材料和試劑]

　　1.呈指數(shù)生長的真核細(xì)胞（如HeLa，BALB/c 3T3，NIH 3T3，CHO，或鼠胚胎成纖維細(xì)胞）

　　2.完全培養(yǎng)液（依所用的細(xì)胞系而定）

　　3.CsCl純化的質(zhì)粒DNA （10～50μg/次轉(zhuǎn)染，二次純化）

　　4.2×HEPES緩沖鹽水（HeBS）

　　（pH6.95～7.05）。50.0mmol/L HePes；280mmol/L NaCl；10mmol/L KCl；1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH調(diào)pH至6.95～7.05，過濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　5.2.5mol/L CaCl2過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>

　　6.磷酸緩沖鹽水（PBS）

　　7.37℃，5%CO2的加濕培養(yǎng)箱

　　8.100mm組織培養(yǎng)平板

　　9.15ml錐形管

　　[方法與步驟]

　　1.傳代細(xì)胞準(zhǔn)備。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24h傳代，待細(xì)胞密度達(dá)50%～60%滿底時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。

　　2.DNA沉淀液的準(zhǔn)備。首先將質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于μL無菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)

　　3.用巴斯德吸管在500μL.2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時(shí)用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個(gè)過程需緩慢進(jìn)行，至少需持續(xù)1～2min。

　　4.室溫靜置30min，出現(xiàn)細(xì)小顆粒沉淀。

　　5.將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動。

　　6.在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下培養(yǎng)細(xì)胞4～16h.除去培養(yǎng)液，用5ml.1×HeBS洗細(xì)胞2次，加入10ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。

　　7.收集細(xì)胞或分入培養(yǎng)皿中選擇培養(yǎng)。

　　[注意事項(xiàng)]

　　1.在整個(gè)轉(zhuǎn)染過程中都應(yīng)無菌操作。

　　2.為獲得最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DNA應(yīng)不含蛋白質(zhì)和酚。乙醇沉淀后的DNA應(yīng)保持無菌，并在無菌水或Tris EDTA中溶解。

　　3.沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時(shí)需用空氣吹打，以確保形成盡可能細(xì)小的沉淀物，因?yàn)槌蓤F(tuán)的DNA不能有效地粘附和進(jìn)入細(xì)胞。

　　4.在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都可能導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。