純化抗血清時如何去除雜蛋白?
在純化抗血清時,去除雜蛋白是提高抗體特異性的重要步驟。以下是幾種常用的方法:
1. 鹽析法:通過改變?nèi)芤旱碾x子強度來沉淀蛋白質(zhì),常用的有硫酸銨或硫酸鈉。這種方法可以初步分離目標(biāo)抗體與一些非目的性蛋白質(zhì)。
2. 凝膠過濾層析:利用不同分子量大小的物質(zhì)在多孔凝膠介質(zhì)中移動速度的不同來進行分離。較小的分子會進入凝膠顆粒內(nèi)部而較大的分子則主要沿外周流動,從而實現(xiàn)大小不同的蛋白分離開來。
3. 離子交換層析:基于蛋白質(zhì)表面電荷差異進行分離的技術(shù)。選擇合適的離子交換劑(如DEAE-纖維素或CM-纖維素),可以使帶相反電荷的抗體優(yōu)先結(jié)合到柱上,在洗脫過程中根據(jù)pH值和鹽濃度的變化將目標(biāo)蛋白與其他雜蛋白分開。
4. 親和層析:利用抗原-抗體之間高度特異性的相互作用,將特定配體(如固定化的抗原)偶聯(lián)到基質(zhì)上制成親和吸附劑。當(dāng)含有多種成分的混合物通過此柱時,只有與該配體有高親合力的目標(biāo)蛋白會被捕獲,其他雜蛋白則被洗脫掉。
5. 超濾法:利用半透膜對不同分子量大小物質(zhì)的選擇透過性來實現(xiàn)分離目的。對于相對分子質(zhì)量較大的目標(biāo)抗體來說,可以通過超濾去除小分子雜質(zhì)和部分非特異性蛋白質(zhì)。
6. 高效液相色譜(HPLC):這是一種高分辨率的層析技術(shù),適用于微量樣品的純化。通過調(diào)整流動相組成、溫度等條件可以實現(xiàn)對復(fù)雜混合物中各組分的有效分離。
在實際操作過程中,往往需要結(jié)合多種方法以達到最佳效果,并且每一步都需嚴(yán)格控制實驗條件,確保最終獲得高度純凈的目標(biāo)抗體。
1. 鹽析法:通過改變?nèi)芤旱碾x子強度來沉淀蛋白質(zhì),常用的有硫酸銨或硫酸鈉。這種方法可以初步分離目標(biāo)抗體與一些非目的性蛋白質(zhì)。
2. 凝膠過濾層析:利用不同分子量大小的物質(zhì)在多孔凝膠介質(zhì)中移動速度的不同來進行分離。較小的分子會進入凝膠顆粒內(nèi)部而較大的分子則主要沿外周流動,從而實現(xiàn)大小不同的蛋白分離開來。
3. 離子交換層析:基于蛋白質(zhì)表面電荷差異進行分離的技術(shù)。選擇合適的離子交換劑(如DEAE-纖維素或CM-纖維素),可以使帶相反電荷的抗體優(yōu)先結(jié)合到柱上,在洗脫過程中根據(jù)pH值和鹽濃度的變化將目標(biāo)蛋白與其他雜蛋白分開。
4. 親和層析:利用抗原-抗體之間高度特異性的相互作用,將特定配體(如固定化的抗原)偶聯(lián)到基質(zhì)上制成親和吸附劑。當(dāng)含有多種成分的混合物通過此柱時,只有與該配體有高親合力的目標(biāo)蛋白會被捕獲,其他雜蛋白則被洗脫掉。
5. 超濾法:利用半透膜對不同分子量大小物質(zhì)的選擇透過性來實現(xiàn)分離目的。對于相對分子質(zhì)量較大的目標(biāo)抗體來說,可以通過超濾去除小分子雜質(zhì)和部分非特異性蛋白質(zhì)。
6. 高效液相色譜(HPLC):這是一種高分辨率的層析技術(shù),適用于微量樣品的純化。通過調(diào)整流動相組成、溫度等條件可以實現(xiàn)對復(fù)雜混合物中各組分的有效分離。
在實際操作過程中,往往需要結(jié)合多種方法以達到最佳效果,并且每一步都需嚴(yán)格控制實驗條件,確保最終獲得高度純凈的目標(biāo)抗體。
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