1.用脫脂奶粉封閉的效果不一定比用BSA差，不過我們試過幾種奶粉，有一些奶粉不太適合。推薦使用的奶粉：雀巢高鈣奶粉，多力精低脂奶粉。一般國產(chǎn)的奶粉的顆粒比較大，不太容易溶解。

　　2.關(guān)于三名治：本人以前做時花很多時間在防止短路上，現(xiàn)在我做的時候根本沒有剪齊，最主要的是趕氣泡，這是關(guān)鍵的關(guān)鍵，其實轉(zhuǎn)膜的原理是電流的單向流動，現(xiàn)在的好多公司的轉(zhuǎn)膜裝置的電極是一個平面，所以不用擔(dān)心短路的。（不信的可以試試！?。?/P>

　　3.關(guān)于轉(zhuǎn)膜時的溫度：轉(zhuǎn)膜時的溫度比較重要，最好保持在10度以下，可以用冰浴（Pharmacia的轉(zhuǎn)膜裝置），也可以在轉(zhuǎn)膜液中放入合適的事先準(zhǔn)備的冰袋（-70度>3小時）（Bio-Rad），這樣既可以降溫又可以節(jié)約Buffer. 4.關(guān)于轉(zhuǎn)膜電流和時間：一般轉(zhuǎn)膜的電流在200mA-400mA之間時間為1小時，大片段的>50KD的可以選用350mA，小片段的可以用250mA，不過本人覺得上述電流均能很好的把大部分蛋白轉(zhuǎn)過去。

　　5.關(guān)于反復(fù)標(biāo)記和再標(biāo)記：一張膜上可以同時標(biāo)記很多抗體，但要注意，一般在兩個目的蛋白相差在5KD以上的，最好先后兩個抗體是不同的二抗。在兩個目的片段相差小于5KD時，就需要經(jīng)過處理，再標(biāo)記了（Re-Blot），有些公司有再標(biāo)記的現(xiàn)成試劑，不過比較貴，最簡單的方法是：ddH2O洗5分鐘，0.2MNaOH5分鐘，再用ddH2O5分鐘*3次，然后可以再標(biāo)記了。要做多個抗體的膜\的選擇，最好用PVDF或教堅固的，推薦用Amsham的Hybond-P，Hybond-Extra.本人最多在一張膜上做個10個不同的抗體。